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本试剂盒通过T7 RNA Polymerase从模板DNA T7启动子下游开始合成与DNA模板中一条链互补的RNA，本试剂盒通过对转录体系进行优化，可以简单快速的获得大量RNA分子。在底物中加入带修饰的核苷酸进行转录反应，还可以用于制备生物素或染料标记的RNA探针。本试剂盒投入1μg模板量可以产生150～200μg的RNA，转录合成的RNA可用于体外翻译、RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、反义RNA和RNAi、显微注射及RNA疫苗等多方面的下游应用。

• 用于RNA合成的器具须用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液37℃浸泡12h；然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
  
• 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60min)或者上述DEPC处理的器具盛装，使用的无菌水须用0.1% DEPC处理后进行高温高压灭菌。建议RNA实验使用的器具、试剂和无菌水专用。
  
• 请使用不含RNA和DNA酶的枪头、离心管进行实验。
  
• 在进行实验操作时应将酶放置于冰上，待实验结束后于-20℃保存。

• 质粒模板：带T7启动子的质粒可以作为转录模板，但是环状质粒因为没有有效的终止，转录出的RNA产物会出现不同片段长度，为了得到特定长度的RNA，质粒必须进行线性化处理，线性化的质粒需要确保双链为平末端或编码链5’端为突出结构，所以推荐使用Ⅱ类限制性内切酶，注意酶的识别位点不能在目的片段中存在，以保证模板的完整。线性化的质粒建议纯化后作为模板使用，以减少RNase、蛋白及盐残留对转录反应体系的影响。
  
  每个反应建议投入1μg线性化质粒作模板。
• PCR产物模板：带T7启动子的PCR产物也可作为体外转录模板，此时将T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)加在有义链的上游引物的5'端。PCR产物可以不经纯化直接作为模板，但纯化后能提高RNA得率。
  
  PCR产物为转录模板，电泳确认产物的单一性，建议每个反应体系中投入0.1～0.5μg模板。
• 合成的DNA模板：合成的带有T7启动子的DNA片段也可以作为体外转录的模板。
  
  推荐每个反应体系中投入0.1～0.5μg模板。

• 转录方案：
  
  
  
  
• 体外转录：
  RNA的转录方案如图所示，请参考图中DNA设计转录模板。本试剂盒不提供修饰的NTP和帽子类似结构。
  
  • 将除酶混合物外的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用。
    
  • 按下表配制反应体系，建议模板加入0.1～1μg。
    

    成分	用量
    5×转录缓冲液	4μL
    ATP溶液	1.5μL
    CTP溶液	1.5μL
    GTP溶液	1.5μL
    UTP溶液	1.5μL
    酶混合物	1.5μL
    RNase抑制剂	0.5μL
    模板DNA	X μL
    无核酸酶双蒸水	至20μL

    加入各转录组分时请最后加入转录模板。
  • 用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育3h。
    
    可根据产物片段大小适当的调整反应时间，如合成小于0.3kb的RNA，可将反应延长至4h或更长时间，16h过夜反应不会影响产物的质量，为避免蒸发对反应体系的影响，建议在PCR仪中进行反应。
  • 在反应体系中加入2μL的DNase I(RNase-free)，37℃孵育20min，消化转录的DNA模板，然后加入2μL的0.5M EDTA，65℃孵育10min终止消化反应。(可选)
    
    相对于产物RNA，模板DNA的含量非常低，一般不用去除，也可以用DNase I消化。
  • 合成的RNA经电泳分析、纯化后，可用于下游实验。
• 产物纯化：
  
  • 氯化锂纯化：采用氯化锂沉淀法，RNA长度要大于300nt，且浓度不能低于100ng/μL。
    
    • 20μL的转录体系中加入30μL的氯化锂沉淀溶液和30μL的无核酸酶双蒸水。
      
    • 混匀后-20℃放置至少30min。
      
    • 12000rpm离心10min，去上清，收集沉淀。
      
    • 加入500μL预冷的70%乙醇上下颠倒清洗，然后12000rpm，离心3min；
      
    • 重复3次步骤④。
      
    • 开盖干燥2～5min，加入50～100μL无核酸酶双蒸水或其他缓冲液溶解RNA沉淀，-80℃保存。
  • 酚/氯仿纯化：酚/氯仿抽提可去除蛋白和大部分游离核苷酸。
    
    • 加入无核酸酶双蒸水将产物稀释至135μL。
      
    • 加入15μL 3M的醋酸钠(pH5.2)到稀释后的产物中，用移液器充分混匀。
      
    • 加入150μL的酚/氯仿混合液(1∶1)进行抽提，4℃ 12000rpm离心10min，将上层溶液(水相)转移至新的RNase-free EP管中。
      
    • 加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集水相。
      
    • 加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃放置至少30min，4℃ 12000rpm离心10min。
      
    • 弃上清并加入500μL预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 12000rpm离心5min，弃上清。
      
    • 开盖干燥2～5min，加入50～100μL无核酸酶双蒸水或其他缓冲液溶解RNA沉淀，-80℃保存。
  • 柱纯化：柱纯化可以去除蛋白和游离核苷酸，按柱纯化说明书进行纯化即可。
    
    由于RNA产量较高，为避免超出结合柱的承载能力，请对所需柱子数量进行预估。
• RNA定量：
  
  • 紫外吸收法：游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。
    
  • 染料法：可选择相关染料定量产品(RNA快速定量试剂盒)进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或者未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。

• 转录产物产量低
  转录反应的模板对转录的效果和产量的多少起着关键的作用，如转录产物产量较低，可能的原因：
  
  • 模板中有抑制反应的成分；
    
  • 模板本身序列、长度、结构等原因，序列＜0.3kb时，会对转录反应有一定抑制作用。
  请尝试以下方案解决：
  
  • 如果是模板含有抑制反应的成分，可以重新纯化模板，确定模板定量以及其完整性；
    
  • 如果是模板本身序列问题，可以尝试延长37℃反应时间(4h-过夜反应16h)，加大模板投入量，可以有效提高RNA产量。
• 产物电泳拖尾现象
  电泳过程中有拖尾现象，可能的原因如下：
  
  • 实验操作过程中存在RNase污染；
    
  • DNA模板中存在RNase污染。
  请尝试以下方案解决：
  
  • 建议重新纯化模板DNA，并在实验过程中规范操作，实验中所用试剂均用无核酸酶双蒸水来配制，使用RNase-free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩等。
• RNA产物片段大于预期
  如果电泳显示产物条带大于预期，可能的原因如下：
  
  • 质粒模板可能没有完全线性化；
    
  • 有义链3'端为突出结构；
    
  • RNA存在未完全变性的二级结构。
  请尝试以下方案解决：
  
  • 确认模板结构，并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。
• RNA产物片段小于预期
  如果电泳显示产物条带小于预期，可能的原因如下：
  
  • 模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列；
    
  • 模板中GC含量高，形成高级结构；
    
  • 反应过程中存在RNase污染。
  请尝试以下方案解决：
  
  • 如果是模板序列中含有类似T7 RNA聚合酶的终止序列，建议尝试不同类型的RNA聚合酶进行转录；
    
  • 如果是模板中GC含量过高，可以加入SSB蛋白进行反应；请注意操作规范，减少实验过程中的RNase污染。